Рестрикционные ферменты

Фермент рестрикции представляет собой бактериальный белок, который расщепляет ДНК в определенных местах, эти сайты называются сайтами рестрикции. Ферменты рестрикции защищают живые бактерии от бактериофагов. Они идентифицируют бактериофаг и расщепляют его по сайтам рестрикции, разрушая его ДНК. Важные инструменты генной инженерии включают ферменты рестрикции. Их можно отделить от бактерий и применять в исследовательских учреждениях. Последовательности узнавания или короткие и отчетливые последовательности нуклеотидов распознаются ферментами рестрикции в ДНК. Когда последовательность ДНК распознается ферментом рестрикции, он гидролизует связь между соседними нуклеотидами и расщепляет молекулу ДНК. Бактерии используют ферменты метилазы для добавления метильной группы к адениновым или цитозиновым основаниям в последовательности распознавания, предотвращая распад последовательностей ДНК.

История

В 1970 году был открыт и идентифицирован первый фермент рестрикции. С тех пор было тщательно исследовано более 3000 рестрикционных ферментов, и более 600 из них в настоящее время коммерчески доступны и часто используются в лабораториях для модификации и изменения ДНК. В 1963 году ученые открыли два фермента, ограничивающих развитие бактериофагов в кишечной палочке. Один из них был ферментом, разрезавшим ДНК, а другой добавлял к ДНК метильные группы. Позднее ей было дано название эндонуклеаза рестрикции. Эти ферменты делятся на экзонуклеазы и эндонуклеазы в зависимости от того, как они функционируют.

Экзонуклеазы и эндонуклеазы

• Экзонуклеазы : Ограничения Экзонуклеазы, такие как экзонуклеаза I, экзонуклеаза II и т. д., в значительной степени ответственны за гидролиз концевых нуклеотидов с конца молекул ДНК или РНК либо в направлении от 5' к 3', либо от 3' к 5'.
• Эндонуклеаза : Эндонуклеазы рестрикции идентифицируют определенные последовательности оснований (сайты рестрикции) в молекулах ДНК или РНК и катализируют расщепление внутренних фосфодиэфирных связей с помощью таких ферментов, как EcoRI, Hind III и BamHI.

Сайт признания

Молекулы ДНК содержат сайты рестрикции, также известные как сайты распознавания рестрикции, которые представляют собой определенные (длиной 4–8 пар оснований) нуклеотидные последовательности, распознаваемые ферментами рестрикции. Поскольку ферменты рестрикции часто связываются в виде гомодимеров, эти последовательности обычно палиндромны. Конкретный фермент рестрикции может разрезать последовательность между двумя нуклеотидами в своем сайте распознавания или где-то рядом.

Например, когда распознается палиндромная последовательность GAATTC, обычный фермент рестрикции EcoRI делает разрез между G и A как на верхней, так и на нижней цепях. В результате на каждом конце AATT остается липкий конец — сегмент нити ДНК без связанного комплемента. Сегмент ДНК с комплементарным выступающим фрагментом затем можно лигировать в выступающий фрагмент (например, другой фрагмент, вырезанный EcoRI).

Типы

1. Ферменты типа I. Эти ферменты рестрикции разрезают ДНК в любом отдаленном положении от сайта узнавания. Уникальные АТФ и S-аденозил-L-метионин запускают активацию этих ферментов рестрикции. Эти ферменты по-прежнему уникальны и выполняют множество функций, включая метилазу и рестрикционное расщепление.
2. Ферменты типа II. Этот тип рестрикционных ферментов может расщеплять или расщеплять ДНК из места, близкого к фактическому сайту распознавания. Для правильной работы требуется много магния. Этот фермент предназначен для одноразового использования и не зависит от метилазы.
3. Ферменты типа III. Кроме того, этот рестрикционный фермент фрагментирует ДНК в месте, близком к реальному сайту узнавания. Для работы ему нужна АТФ, но не нужна гидролаза. Для начала реакции необходим S-аденозил-L-метионин. Однако, как только реакция начинается, активность фермента не имеет значения. С помощью модификационной метилазы этот рестрикционный фермент может помочь в расщеплении ДНК.
4. Тип IV. Фермент рестрикции типа IV представляет собой уникальную эндонуклеазу, которая работает только с ДНК, которая была изменена. Эта эндонуклеаза рестрикции, работающая с ДНК, часто используется в биотехнологической промышленности. Метилированные и гидроксиметилированные ферменты являются двумя примерами ферментов рестрикции.
5. Тип V. Рестрикционный фермент типа V не действует как фермент ДНК-реакции. Направляющая РНК, известная как гРНК, катализирует действие этой рестрикционной эндонуклеазы на РНК.

Искусственные ферменты рестрикции

Связывая искусственный домен нуклеазы с синтетическим ДНК-связывающим доменом, можно создавать ферменты рестрикции. Такие синтетические рестрикционные ферменты могут связываться со специфическими последовательностями ДНК и могут нацеливаться на большие участки ДНК (до 36 п.н.). Наиболее популярными искусственными ферментами рестрикции являются нуклеазы цинковых пальцев, которые обычно используются в генной инженерии, но также могут использоваться в более традиционных процедурах клонирования генов. ДНК-связывающий домен эффекторов TAL служит основой для дополнительных синтетических ферментов рестрикции.

В 2013 году был разработан инструмент редактирования генома CRISPR-Cas9, основанный на механизме защиты от прокариотических вирусов. Его быстро приняли в лабораториях. Также созданы синтетические рибонуклеазы, которые функционируют как ферменты рестрикции РНК. PNAzyme представляет собой систему на основе ПНК, которая имитирует рибонуклеазы для определенной последовательности РНК и расщепляет участок, не состоящий из пар оснований (выпуклость РНК) целевой РНК, образующийся при связывании фермента с РНК. Эта область известна как выпуклость РНК. Этот фермент проявляет селективность, расщепляя только один из двух потенциальных сайтов расщепления, которые либо кинетически благоприятны, либо не имеют несоответствия.

Номенклатура

С момента их открытия в 1970-х годах было проведено множество идентификаций рестрикционных ферментов; например, было охарактеризовано более 3500 различных рестрикционных ферментов типа II. Используя схему именования, основанную на роде, виде и штамме бактерий, каждый фермент получает название в честь бактерии, из которой он был получен.
Например, название фермента рестрикции EcoRI

Важность

Крайне важно понимать рестрикционные ферменты, поскольку они используются в полиморфизмах длины рестрикционных фрагментов, которые выявляют генетические различия и мутации, а также при лечении рака. Они состоят из двух длинных нитей ДНК, слитых с этими рестрикционными ферментами, чтобы найти определенные последовательности ДНК и расщепить их там. Он используется, чтобы отличить тип мутации от вариации. Ферменты рестрикции распознают два нуклеотида на одной цепи ДНК, которые затем расщепляют цепь. Нуклеотидная последовательность определенного типа в сегменте ДНК может быть разрезана ферментами рестрикции. Таким образом, анализ ДНК проводится с использованием этих ферментов.

Способы изучения ферментов рестрикции

Вот некоторые из лучших методов исследования ферментов рестрикции:

• Понимание основ. Крайне важно освоить основы каждого типа ферментов.
• Эксперимент. Старайтесь использовать ферменты в каждом эксперименте.
• Представьте себе, что произошло бы, если бы фермент не использовался в эксперименте.
• Попробуйте — попробуйте написать эссе о ферменте.

Заявление

В исследованиях молекулярной биологии эндонуклеазы рестрикции часто используются для следующих целей:

1. Генная инженерия : Эндонуклеазы рестрикции чаще всего используются в качестве метода генной инженерии. Геном организма-хозяина можно модифицировать и вводить интересные последовательности благодаря эндонуклеазной активности. В результате хозяин производит желаемый генный продукт. Эта идея имеет множество биотехнологических применений, включая создание антибиотиков, антител, ферментов и нескольких вторичных метаболитов.
2. Ферменты рестрикции используются при картировании ДНК , иногда называемом рестрикционным картированием, для сбора структурных данных о фрагменте ДНК. Этот метод позволяет получать фрагменты ДНК различных размеров путем расщепления ДНК последовательностью рестрикционных ферментов. Используя электрофорез в агарозном геле для разделения полученных фрагментов, можно рассчитать расстояние между сайтами рестрикционных ферментов. Это может быть использовано для установления структуры фрагмента ДНК.
3. Секвенирование генов включает в себя переваривание большой молекулы ДНК рестрикционными ферментами, а затем пропускание полученных фрагментов через секвенатор ДНК для определения последовательности нуклеотидов.
4. Исследования экспрессии генов, мутаций и полиморфизма популяций - это некоторые из других применений эндонуклеаз рестрикции.

Примеры

EcoRI, HindIII и NotI — несколько хорошо известных примеров ферментов рестрикции.

Часто задаваемые вопросы о ферментах рестрикции

Вопрос 1: Дайте определение ферментам рестрикции и сайтам узнавания.

Отвечать:

It is an enzyme that cleaves DNA into pieces at or close to particular molecular recognition sites. A recognition site is a location that a restriction enzyme selects in order to break DNA.
These locations are found on a DNA molecule and contain particular nucleotide sequences (4-8 base pairs)

Вопрос 2: Напишите приложения рестриктазы.

Отвечать:

Applications of the restriction enzyme:

1. Genetic engineering
2. Used in methods for DNA fingerprinting.
3. They help in gene cloning, protein expression research, and the insertion of genes into plasmid vectors.
4. By specifically identifying single base variations in DNA as single nucleotide polymorphism, they are also useful to distinguish gene alleles.
5. DNA mapping.
6. Gene sequencing.

Вопрос 3: В каком году был открыт первый фермент рестрикции?

Отвечать:

 In 1970 the first restriction enzyme was identified.

Вопрос 4: Напишите разницу между эндонуклеазой и экзонуклеазой.

Отвечать: